Kurzfassung

Das krankheitsfreie Überleben von Leukämiepatienten nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) wird sehr wesentlich durch die Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) und den Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekt bestimmt. Als Mediatoren der GvHD und des GvL-Effekts werden alloreaktive T-Zellen des Stammzellspenders vermutet, die HLA-assoziierte Peptidepitope aus Minor-Histokompatibilitäts- und Leukämie-assoziierten Antigenen erkennen. Die Kenntnis dieser Zielstrukturen...Das krankheitsfreie Überleben von Leukämiepatienten nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) wird sehr wesentlich durch die Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) und den Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekt bestimmt. Als Mediatoren der GvHD und des GvL-Effekts werden alloreaktive T-Zellen des Stammzellspenders vermutet, die HLA-assoziierte Peptidepitope aus Minor-Histokompatibilitäts- und Leukämie-assoziierten Antigenen erkennen. Die Kenntnis dieser Zielstrukturen alloreaktiver T-Zellen eröffnet neue Möglichkeiten, die Spezifität und Effektivität der allogenen HSZT zu verbessern. Im Rahmen dieses Projektes werden aus Blutlymphozyten HLA-gematchter gesunder Spender durch gemischte Lymphozyten-Leukämiezell-Kulturen (MLLC) CD8+ T-Zelllinien mit Reaktivität gegen Leukämiezellen generiert. Anschließend erfolgt eine Klonierung der Responderlymphozyten mittels des Grenzverdünnungsverfahrens (Limiting Dilution-Assay). Expandierte klonale und nichtklonale T-Zellen werden in FACS-Analysen phänotypisiert und in funktionellen Assays (Zytokin-ELISPOT, 51Chrom-Zytotoxizitätstest) auf Reaktivität gegen Leukämiezellen und gesunde Körperzellen (PHA-Lymphoblasten, Fibroblasten, Keratinozyten) getestet. Die HLA-Klasse-I-Restriktion der Responderpopulationen wird durch Antikörper-vermittelte Blockade des HLA-Restriktionselements bestimmt. Zur Identifizierung der von den CD8+ T-Zellen erkannten Peptidantigene wird eine biochemische Aufreinigung der HLA-Klasse-I-assoziierten Peptidliganden mit nachfolgender Sequenzanalyse durch Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt. Dazu werden aus einem Lysat von > 1010 Leukämiezellen die HLA-Klasse-I-Moleküle mittels Immunchromatographie aufgereinigt, die HLA-assoziierten Peptide durch Säureinkubation eluiert und anschließend in einer analytischen reverse phase-HPLC nach Löslichkeit aufgetrennt. HPLC-Fraktionen, die nach Beladung von antigennegativen HLA-exprimierenden Zielzellen im 51Chrom-Zytotoxizitätstest T-Zellerkennung induzieren, enthalten das bioaktive Peptidepitop. Die einzelnen Peptidspezies dieser Fraktionen werden nach erneuter Auftrennung durch mikrokapilläre LC mittels MALDI- oder ESI-Massenspektrometrie sequenziert. Kandidatenepitope werden peptidchemisch synthetisiert und auf Induktion von Bioaktivität in den leukämiereaktiven T-Zellen mittels ELISPOT oder 51Chrom-Zytotoxizitätstest untersucht. Ist ein T-Zellepitop identifiziert, soll durch Homologiesuche in Gen/Protein-Banken das für das Peptidantigen kodierende Gen/Protein gefunden werden. Es schließen sich weitere Arbeiten zur Gewebeexpression dieses Antigens sowie zum Nachweis und zur Quantifizierung von T-Zellantworten gegen dieses Antigen im Blut von Leukämiepatienten und gesunden Testpersonen mittels ELISPOT- oder HLA-Tetramer-Analyse an. Damit soll die Relevanz eines Antigens für die Entwicklung einer GvHD sowie eines GvL-Effekts geklärt werden. Sollte das Antigen präferentiell in Leukämiezellen exprimiert sein, interessiert uns die Frage, ob es sich zum Einsatz in Studien zur therapeutischen Vakzinierung oder zum adoptiven T-Zelltransfer eignet. » weiterlesen» einklappen