Kurzfassung

Der Transkriptionsfaktor NFκB reguliert Gene, die für Entzündungsprozesse, Apoptoseresistenz und Tumorentstehung von entscheidender Bedeutung sind (Karin M, Nature 2006). NFκB ist normalerweise durch Bindung an inhibitorische Proteine (IκB) inaktiv im Zytoplasma lokalisiert. Nach Stimulation durch Mitglieder der TNF-Zytokine Familie wird über eine Rekrutierung von TRAF-2 eine Aktivierung des IKK-(IκB Kinase) Komplexes (bestehend aus IKKα, IKKβ und IKKγ [NEMO]) bewirkt, was zur...Der Transkriptionsfaktor NFκB reguliert Gene, die für Entzündungsprozesse, Apoptoseresistenz und Tumorentstehung von entscheidender Bedeutung sind (Karin M, Nature 2006). NFκB ist normalerweise durch Bindung an inhibitorische Proteine (IκB) inaktiv im Zytoplasma lokalisiert. Nach Stimulation durch Mitglieder der TNF-Zytokine Familie wird über eine Rekrutierung von TRAF-2 eine Aktivierung des IKK-(IκB Kinase) Komplexes (bestehend aus IKKα, IKKβ und IKKγ [NEMO]) bewirkt, was zur Phosphorylierung der inhibitorischen IκBs und deren Degradation durch das Proteasome führt. NFκB wird konsekutiv freigesetzt, transloziert in den Kern und führt dort zur Transkriptionsregulation und Genexpression (klassischer Signalweg) (Ghosh S, Cell 2002). Die herausragende Bedeutung des NFκB Signalweges für intestinale Inflammationsprozesse (Zhang J, JCI 2006, Nenci A, Nature 2007) und die Entstehung von Lebertumoren (Luedde T, Cancer Cell 2007) wurde mehrfach gezeigt. CYLD ist ein Tumorsuppressor-protein, welches durch seine de-ubiquitinierenden Eigenschaften zur Deaktivierung von TRAF-2 und NEMO führt und dadurch in der Lage ist, NFκB innerhalb des klassischen Signalweges zu inhibieren (Trompouki E, Nature 2003). Ein Verlust dieses Tumor-suppressorgens führt zum Krankheitsbild der familiären Zylindromatose. In der Arbeitsgruppe des Antragstellers ist bereits ein CYLD Knockout-Mausmodel etabliert. Als Ausdruck der erhöhten NFκB Aktivität zeigte sich phänotypisch eine deutlich erhöhte Zahl an B-Zellen, was zur Lymphknoten-vergrößerung und Splenomegalie führt (Hövelmeyer N, J Exp Med 2007).
Bcl-3, ein weiteres Mitglied der IκB Familie, welches jedoch als Oncogene wirkt, wurde zunächst in einer Subgruppe von B-Zell-Lymphomen (B-CLL) identifiziert (McKeithan TW, Genes Chromosomes Cancer 1990). Nach Translokation in den Zellkern bindet Bcl-3 an die beiden NFκB-Untereinheiten p50 und p52 und bewirkt durch Aktivierung des Cyclin D1-Promoters eine gesteigerte Zellproliferation und Tumorentstehung (Westerheide SD, Mol.Cell Biol. 2001). Es konnte gezeigt werden, dass CYLD auch Bcl-3 de-ubiquitinieren und damit inhibieren kann. Nach chemischer Induktion entstehen in CYLD-defizienten Mäuse durch fehlende Bcl-3 Inhibierung vermehrt Hauttumoren (Massoumi R, Cell 2006).

Durch den Antragssteller ist ein konditionales Mausmodel generiert worden, welches die konditionale und organspezifische Überexpression von Bcl-3 nach Cre-vermittelter Rekombination ermöglicht. Die kodierende Region des Bcl-3 Gens ist in den ubiqitär vorhandenen ROSA26 Lokus unter Kontrolle des CMV early enhancer/chicken ß-actin (CAG) Promoter muriner Stammzellen eingebracht worden. Die Überexpression von Bcl-3 in dieser Mauslinie, genannt R26-STOP-Bcl-3, wird nur nach Cre-vermittelter Rekombination und Deletion einer loxP-flankierten STOP Kassette ermöglicht.
Die ubiquitäre Überexpression (Bcl-3/Deleter-Cre) führt zu einer deutlichen Vergrößerung der Milz sowie der axillären und mesenterialen Lymphknoten. Gleichzeitig haben diese Tiere weniger Peyers Patches. Dieser Phänotyp ist ab einem Alter von 4 Wochen zu verzeichnen und verstärkt sich mit zunehmendem Alter. Zudem sind die Tiere kleiner, leichter, besitzen so gut wie kein subkutanes Fettgewebe und versterben nach 4-6 Monaten. In der Milz ist eine Zunahme an B-Zell Follikeln zu verzeichnen. Diese haben eine gestörte Mikroarchitektur mit einer deutlichen Vermehrung an ausgereiften B-Lymphozyten bei gleichzeitiger Reduktion an T-Lymphozyten sowie fehlenden Marginal Zone B-Zellen. Im Southern Blot konnten polyklonale B-Zell-Populationen als Vorstufen eines malignen Lymphoms detektiert werden. Ein ähnlicher Phänotyp konnte durch die Verpaarung mit CD19-Cre Mäusen (Bcl-3 Überexpression ausschließlich in B-Lymphozyten) induziert werden. Neben einer stark vergrößerten Milz, besitzen diese Tiere wesentlich mehr B-Zellen, eine reduzierte Zahl an T-Zellen, keine Marginal Zone B-Zellen sowie nach Immunisierung mit NP-CG keine Germinal Center B-Zellen. In beiden Stämmen konnte der Phänotyp durch eine Verpaarung mit homozygoten Bcl-3 Tieren verstärkt werden. Die Verpaarung von homozygoten Bcl-3 Tieren mit CD4-Cre Mäusen führt interessanterweise zur spontanen Entwicklung einer Colitis nach ca. 6-8 Wochen, wobei eine reduzierte Zahl an CD4 T-Zellen, Memory effector T-Zellen und regulatorischen T-Zellen in Thymus, Milz und Lymphknoten zu verzeichen ist.
Chronische Hepatitiden und das hepatozelluläre Karzinom (HCC) sind klassisch inflammationsgetriggerte Erkrankungen, bei denen eine vermehrte NFκB-Aktivität nachzuweisen ist. Ziel des beantragten Projektes ist es daher, die Rolle von Bcl-3 bei hepatischen Entzündungsprozessen, der Apoptoseresistenz und der Hepatokarzinogenese im Mausmodell zu untersuchen. Nach Verpaarung von homozygoten Bcl-3 Tieren mit ALFP-Cre Mäusen (ausschließlich hepatische Bcl-3 Überexpression) steht die benötigte Mauslinien zur Umsetzung dieses Projektes bereits zur Verfügung.

Geplantes Vorgehen:
Rationale:
Die Ergebnisse, die im Rahmen der bisher untersuchten Mauslinien (Bcl-3/Deleter-Cre, Bcl-3/CD4-Cre, Bcl-3/CD19-Cre) erzielt wurden, weisen darauf hin, dass die Überexpression von Bcl-3 zu massiven Veränderungen der B-/T-Zellhomöostase führt, was sowohl zur spontanen Entstehung von intestinalen Entzündungsprozessen (Colitis) als auch zur Entstehung von Vorstufen maligner Lymphome führt.
Chronische Hepatitiden und das hepatozelluläre Karzinom (HCC, primärer Leberkrebs) sind klassisch inflammationsgetriggerte Erkrankungen, bei denen eine vermehrte NFκB-Aktivität nachzuweisen ist.

Ziel:
Ziel des beantragten Projektes ist es daher, die Rolle von Bcl-3 bei hepatischen Entzündungsprozessen, der Apoptoseresistenz und der Hepatokarzinogenese im Mausmodell zu untersuchen. Nach Verpaarung von homozygoten Bcl-3 Tieren mit ALFP-Cre Mäusen (ausschließlich hepatische Bcl-3 Überexpression) steht die benötigte Mauslinie zur Umsetzung dieses Projektes bereits zur Verfügung.

Geplantes Vorgehen:
1. Auswirkungen der leberspezifischen Bcl-3 Überexpression auf die murine Leber
Zunächst sollen die Auswirkungen der leberspezifischen Bcl-3 Überexpression auf die murine Leber untersucht werden. Den entsprechenden Tieren (Bcl-3/ALFP-Cre) sowie Wildtyp-Mäusen sollen zu festgelegten Zeitpunkten Blut entnommen werden und die Höhe der Transaminasen (GOT/GPT) als Ausdruck der Leberschädigung gemessen werden.
Darüber hinaus sollen die Lebern zu festgelegten Zeitpunkten makros- und mikroskopisch (HE-Färbung) auf die spontane Entwicklung von Tumoren (Adenomen/Karzinomen) hin untersucht werden.
Den Tieren soll Lebergewebe entnommen werden, um, nach Überprüfung der Bcl-3 Überexpression (auf mRNA- und Proteinebene) Western-Blot-Analysen unter besonderer Berücksichtigung des NFκB Signalweges (TRAF-2, TRAF-6, IKK, IκB, p50/p65, p50/p52, Cyclin D1) durchzuführen.
Darüber hinaus sind immunhistochemische Untersuchungen zur Lokalisation von Bcl-3 in der Leber (nukleär, zytoplasmatisch) geplant.
Desweiteren ist eine Hepatozytenisolierung geplant. Nach Stimulation mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), TNF-α/Cycloheximide bzw. Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) soll das Apoptoseverhalten (Apoptoseresistenz) der Zellen nach der Methode von Nicoletti mittels FACS-Analyse beurteilt werden.

2. Auswirkungen der leberspezifischen Bcl-3 Überexpression auf hepatische Entzündungsprozesse im Rahmen verschiedener Leberzellschädigungsmodelle
Innerhalb der Abteilung sind verschiedene murine Leberzellschädigungsmodelle etabliert. Zunächst ist eine Behandlung mit dem agonistischen CD95-Antikörper Jo2 sowie mit Concanavalin A (ConA) geplant. Hierbei ist zu überprüfen, ob die anzunehmend erhöhte NFκB-Aktivität (durch Bcl-3 Überexpression) zu einer verstärkten Leberschädigung durch vermehrt inflammatorische Prozesse oder aber zu einer verringerten Schädigung durch verstärkt anti-apoptotische Signale führt. Darüber hinaus ist geplant ein Endotoxinämie-Modell anzuwenden, bei denen die Tiere mit Lipopolysaccharid (LPS) und D-Galactosamin (D-GalN) behandelt werden.
Das Ausmaß der Leberschädigung wird in allen Modellen zu festgelegten Zeitpunkten durch Bestimmung der Transaminasen erfolgen. Ebenso werden aus den entnommenen Lebern Schnitte angefertigt, um neben HE Färbungen, den Grad der Schädigung mittels TUNEL-Assay zu bestimmen. Aus Leberlysaten soll mittels Western Blot Analyse die Caspasen-Aktivität (Caspase 3, 8, 9) zur Beurteilung des Apoptoseausmaßes erfolgen.

3. Bedeutung der leberspezifischen Bcl-3 Überexpression für die Hepatokarzinogenese
Die Beeinflussung des NFκB Signalweges kann zur spontanen Entstehung von primären Leberzellkarzinome (HCC) führen (Luedde T, Cancer Cell 2007). Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von Bcl-3 im hepatozellulären Karzinom erhöht ist (O’Neil BH, Oncology 2007). Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass eine fehlende Bcl-3 Inhibierung in Keratinozyten zum vermehrten Auftreten von Hauttumoren nach chemischer Induktion führt (Ramin M, Cell 2006). Die zu überprüfende Hypothese ist, dass es bei vermehrter NFκB-Aktivität durch leberspezifische Bcl-3 Überexpression zum vermehrten bzw. früheren Auftreten von Leberzellkarzinomen kommt. Die Mäuse sollen daher, neben der Überwachung auf die Entstehung spontaner Lebertumoren (siehe 1.), in einem chemisch-induzierbarem HCC-Model eingesetzt werden. Aus diesem Grund soll den Tieren sowie Wildtyp-Mäusen das Kanzerogen Diethylnitrosamin (DEN) in den Bauchraum injiziert werden und zusätzlich Phenobarbital (PB) als Tumorpromotor über das Trinkwasser zugeführt werden. Nach entsprechender Induktionszeit (3-12 Monate) sollen die Lebern makros- und mikroskopisch auf die Anzahl und Größe von Lebertumoren (hyperplastische Läsionen, Adenome, HCC) hin untersucht werden. Darüber hinaus sollen Schnitte angefertigte werden, die mittels Immunhistochemie auf die Verteilung von Bcl-3 innerhalb der Tumorknoten und des tumorfreien Gewebes hin untersucht werden sollen.
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