Kurzfassung

Bisher wurden polymere Nanopartikel und polymere Nanokapseln – in erster Linie basierend auf Polystyrol (PS)– in diversen in vitro Modellen analysiert. Um eine gute Bioverträglichkeit sicher zu stellen, wurde die Zytotoxizität an bEnd3 Zellen (murine Endothelzell-Linie) anhand der Umsetzung von Resazurin in wässriger Lösung untersucht. Das dabei entstandene Resorufin wurde im Plate-Reader quantifiziert. 24 h nach Zugabe des Polymers zeigten sich keine Anzeichen einer erhöhten Zytotoxizität...Bisher wurden polymere Nanopartikel und polymere Nanokapseln – in erster Linie basierend auf Polystyrol (PS)– in diversen in vitro Modellen analysiert. Um eine gute Bioverträglichkeit sicher zu stellen, wurde die Zytotoxizität an bEnd3 Zellen (murine Endothelzell-Linie) anhand der Umsetzung von Resazurin in wässriger Lösung untersucht. Das dabei entstandene Resorufin wurde im Plate-Reader quantifiziert. 24 h nach Zugabe des Polymers zeigten sich keine Anzeichen einer erhöhten Zytotoxizität innerhalb einer aufsteigenden Konzentrationsreihe bis zu c251=1 g/l. Um eine mögliche Veränderung der bEnd3-Zell-Morphologie trotz guter Bioverträglichkeit ausschließen zu können, wurde die Barriereintegrität mittels nicht-invasiver ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing)-Technik nach Zugabe der Nanopartikel näher untersucht. Hierzu wurden die Zellen in spezieller, mit Elektroden versehener Zellkultur-Ware kultiviert und die Veränderung der Impedanz nach Zugabe definierter Polymer-Lösungen (c251= 0-0.5g/l) aufgezeichnet. Eine Abnahme der Impedanz gegenüber nicht behandelten Kontrollen konnte nach 24 h nicht nachgewiesen werden, was auf einen intakten bEnd3-Monolayer zurückzuführen ist. Mittels Fluoreszenzmarkierung wurde die zelluläre Aufnahme konfokalmikroskopisch untersucht. Dabei wurden bEnd3 Zellen auf Glas-Coverslips kultiviert und in definierten Zeitintervallen mit Nanopartikeln (c251=0.1g/l) inkubiert. Zur genauen Lokalisation der verschiedenen Zellkompartimente wurde zusätzlich ein Membranmarker eingesetzt. Bereits 30 min nach Zugabe lässt sich die aufgenommene Fluoreszenz innerhalb der Plasmamembran nachweisen. Innerhalb von 24 h kommt es zu weiterer Akkumulation der Fluoreszenz in bEnd3-Zellen. Anhand eines Lysosomen-Markers konnte eine Co-Lokalisation in Lysosomen weitgehend ausgeschlossen werden. Zur Analyse der BHS (Blut-Hirn-Schranke)-Transzytose wurde ein Transwell-System etabliert, in dem bEnd3-Zellen auf einer PET (Polyethylene Terephthalate)-Membran mit definierten Poren kultiviert und die transzytierten Partikel innerhalb des unteren Komparti-mentes sowohl mikroskopisch als auch fluorometrisch detektiert werden. Dieses Transwell-System lässt sich durch eine Vielzahl an co-kultivierten Zellen erweitern. Nach 24 h konnte keine Fluoreszenz in co-kultivierten murinen Astrocyten detektiert werden (Transwell mit 0.4 µm Porendurchmesser), was auf eine fehlende Transzytose schließen lässt. Nach Vergleichen von verschiedenen Transwells mit unterschiedlichen Porendurchmessern weist CH251 je nach Lösungsmittel unterschiedliche Passagefähigkeiten auf. In H2O ist ein Konzentrationsausgleich über eine Membran mit 3.0 µm Porendurchmesser bereits nach 0.5 h erreicht; bei einem Porendurchmesser von 1.0 µm erst nach 4 h. Medium als Lösungsmittel bewirkt einen Konzentrationsausgleich über eine 3.0 µm Membran nach 1 h. Je nach Hersteller weist eine Membran mit 1.0 µm Poren nach >24 h einen Ausgleich der CH251 Konzentration auf. Obwohl ein Konzentrationsausgleich über eine Membran mit 3.0 µm Porendurchmesser möglich ist, verhindern darauf kultivierte bEnd3 Zellen diesen nach 48 h. Eine Co-Kultur mit murinen Astrocyten zur Polarisierung des bEnd3 Monolayers zeigte sowohl in frischem Astrocyten-Medium, als auch in Astrocyten-konditioniertem Medium bei direktem Kontakt der Zell-Populationen an der Membran-Ober- und –Unterseite eine gesteigerte CH251-Transzytose gegenüber einer bEnd3-Reinkultur nach 24 und 48 h. Dieser Effekt ist schwächer ausgeprägt, werden die Astrocyten nur am Well-Boden und nicht an der Membran-Unterseite (unabhängig von konditionierten Medium) kultiviert. Eine Messung der Barriere-Integrität mittels TEER-Elektrode zeigte keine Unterschiede zwischen einer bEnd3-Reinkultur und einer Co-Kultur mit primären murinen Astrocyten, wodurch die erhöhte Passage der Polymere aufgrund einer Störung der BHS-Integrität ausgeschlossen werden kann.
Die bisherigen Resultate weisen den auf Polystyrol basierenden Partikel als gut bioverträglich aus. Die mikroskopischen Aufnahmen konnten zeigen, dass nach Aufnahme des Polymers dieser zeitabhängig innerhalb der Zelle angereichert wird. In Transwell-Experimenten wurde zudem deutlich, dass eine reine bEnd3-Kultur ohne Interaktion mit murinen Astrocyten keine Transzytose des Polymers zu lässt, wodurch eine notwendige Zellkommunikation mit weiteren Bestandteilen der BHS (Astrocyten, Pericyten, Neuronen) als wahrscheinlich angesehen wird. Diese Hypothese sollte durch eine Erweiterung des bestehenden in vitro Modells näher untersucht werden. Zusätzlich dazu sind weitere konfokalmikroskopische Aufnahmen nötig, um den genauen Verbleib der Nanopartikel innerhalb der bEnd3 Zellen abzuklären.
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