Kurzfassung

Das Mammakarzinom ist in Deutschland der am häufigsten vorkommende bösartige Tumor der Frau. Die Grundlage der Therapie ist die Operation, der sich postoperativ zumeist eine begleitende medikamentöse (= adjuvante) Therapie anschließt.
Bei der Planung der adjuvanten Therapie bei Patientinnen mit einem Mammakarzinom stellen sich zwei grundlegende Fragen. Die erste Frage ist, ob die Patientin über eine Operation hinausgehend behandelt werden muss, und wenn ja, so stellt sich als zweite Frage, von...Das Mammakarzinom ist in Deutschland der am häufigsten vorkommende bösartige Tumor der Frau. Die Grundlage der Therapie ist die Operation, der sich postoperativ zumeist eine begleitende medikamentöse (= adjuvante) Therapie anschließt.
Bei der Planung der adjuvanten Therapie bei Patientinnen mit einem Mammakarzinom stellen sich zwei grundlegende Fragen. Die erste Frage ist, ob die Patientin über eine Operation hinausgehend behandelt werden muss, und wenn ja, so stellt sich als zweite Frage, von welchen Medikamenten die Patientin profitiert. Diese beiden Fragen können mit den bisherigen pathologischen Untersuchungstechniken nur sehr grob beantwortet werden. Dies führt dazu, dass mittlerweile im Zweifelsfall fast jede Patientin adjuvant mit ähnlichen Therapieschemata behandelt wird. Eine Individualisierung der Therapie ist somit nur sehr eingeschränkt möglich. Ein individueller Therapieansatz ist umso wichtiger, da ein substantieller Prozentsatz der Patientinnen bereits durch die Operation alleine geheilt ist, also einer potentiell nebenwirkungsträchtigen adjuvanten Therapie nicht bedarf, und da nicht jede Patientin von einer bestimmten Therapie tatsächlich profitiert.
Durch die Möglichkeit, mittels Genexpressionsanalysen individuelle Profile einzelner Mammakarzinome zu erstellen, besteht die Chance die Therapieentscheidungen besser als bisher auf die jeweilige Patientin zuzuschneiden und somit das therapeutische Nutzen-Risiko-Verhältnis zu optimieren.
In der vorliegenden Studie sollen in Erweiterung der publizierten Voruntersuchungen 1, die am tiefgefroren vorliegenden Überschussmaterial von in der UFK Mainz operierten Mammakarzinomen Genexpressionsanalysen mit dem HG-U133A Microarray von Affymetrix durchgeführt worden waren, zusätzlich Next-Generation Sequenzing (NGS) am formalin-fixierten paraffin-eingebetteten (FFPE) Überschussmaterial durchgeführt werden.
Diese so beschriebene genomische und transkriptomische Architektur der Mammakarzinome wird zweckgebunden mit dem Überleben korreliert,, um die oben aufgeführten Fragen – welche Patientin muss behandelt werden und welche Patientin profitiert von einer speziellen Therapie - retrospektiv zu beantworten.

Vorgehen bei der Genexpressionsanalyse:

- RNA Präparation

Von FFPE Blöcken mit eingebettetem Tumormaterial werden mehrere 10 µm Schnitte angefertigt. Die RNA wird mit Hilfe des „FFPE Clear RNAready Kit“ (AmpTec, Hamburg) gemäß den Vorgaben des Herstellers isoliert. Die RNA Ausbeute wird mittels UV Absorption bestimmt. Die Qualität der RNA wird durch Analyse der ribosomalen RNA Bandenintegrität auf dem Agilent Bioanalyzer beurteilt.


- Next-Generation Sequencing

Ausgehend von 0,2 - 1 µg RNA werden Sequenzier-Bibliotheken hergestellt. Hierzu wird das „TruSeq RNA Sample Prep Kit“ von Illumina nach den Vorgaben des Herstellers benutzt.
Hierbei werden poly(A)-Transkripte durch Bindung an Oligo(d)T-beads angereichert, durch Hitze und Kationen fragmentiert und anschließend in doppelsträngige cDNA umgeschrieben. Die Enden der cDNA werden poliert, phosphoryliert sowie an deren 3‘-Enden ein Adenosin angehängt. Speziell konzipierte Adaptoren mit Überhang-Thymidinen können so daranligiert werden und bringen zusätzliche Sequenzen an die Bibliotheken-Moleküle, so dass diese in der anschließenden PCR amplifiziert werden können. Nach qualitativer und quantitativer Kontrolle der Bibliotheken werden sie auf dem Illumina HiSeq 2000 sequenziert und die draus resultierenden Expressionsprofile analysiert.

Vorgehen bei der Analyse von somatischen Mutationen:

- Präparation von genomischer DNA aus FFPE (Tumor)

Von FFPE Blöcken mit eingebettetem Tumormaterial werden mehrere 10 µm Schnitte angefertigt. Die DNA wird mit Hilfe des „QIAamp DNA FFPE Tissue Kit“ (Qiagen, Hilden) gemäß den Vorgaben des Herstellers und optimierter Protokolle isoliert. Die DNA Ausbeute wird mittels UV Absorption bestimmt. Die Qualität der DNA wird durch Gelelektrophorese bestimmt.

- Präparation von genomischer DNA aus PBMCs (gesunde Kontrollprobe)

Aus Vollblut werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) isoliert. Die DNA aus diesen Zellen wird mit Hilfe des „DNeasy Blood & Tissue Kit“ (Qiagen, Hilden) gemäß den Vorgaben des Herstellers isoliert. Die DNA Ausbeute wird mittels UV Absorption bestimmt.

- Next-Generation Sequencing

Ausgehend von 1 µg genomischer DNA (gilt für Tumor und für gesunde Kontroll-Probe) werden Sequenzier-Bibliotheken hergestellt. Hierzu wird das „SureSelect Library Prep kit“ von Agilent nach den Vorgaben des Herstellers benutzt.
Hierbei wird die DNA durch Ultraschall in kleine Fragmente geschert. Die Enden der cDNA werden poliert, phosphoryliert sowie an deren 3‘-Enden ein Adenosin angehängt. Speziell konzipierte Adaptoren mit Überhang-Thymidinen können so daranligiert werden und bringen zusätzliche Sequenzen an die Bibliotheken-Moleküle, so dass diese in der anschließenden PCR amplifiziert werden können. Nach qualitativer und quantitativer Kontrolle der Bibliotheken werden mit dem „SureSelectXT Human All Exon 50Mb kit“ (Agilent) alle DNA-Bereiche der Bibliotheken, die für Exons codieren, angereichert. Dazu werden die entsprechenden DNA-Fragmente an RNA-Moleküle mit definierten Sequenzen hybridisiert, alle nicht-gebundenen Moleküle weg gewaschen und die gewünschten Fragmente wieder eluiert. Nach qualitativer und quantitativer Kontrolle der Exon-angereicherten Bibliotheken werden sie auf dem Illumina HiSeq 2000 sequenziert. Die Sequenzergebnisse der Tumorprobe werden mit den Sequenzergebnissen der gesunden Kontroll-Probe verglichen, um herauszufinden, an welchen Stellen der Gene sich somatische Mutationen befinden. Diese Mutationen werden nach ihrer Priorität geordnet und mit den entsprechenden RNA-Daten verglichen, um die Höhe der Expression des Genes zu bestimmen.» weiterlesen» einklappen