Kurzfassung

Clostridium difficile ist ein anaerob-wachsender, Sporen-bildender, grampositiver Keim, der Ende der 70er Jahre als ätiologisches Agenz der Antibiotika-assoziierten Diarrhoe und der Pseudomembranösen Kolitis identifiziert wurde. Seit den 90er Jahren wird C. difficile weltweit als der bedeutendste Krankenhauskeim der entwickelten Länder angesehen. C. difficile ist ursächlich für ca. 20% aller Antibiotika-assoziierter Durchfälle, 75% aller Antibiotika-assoziierter Colitis- und 100% aller...Clostridium difficile ist ein anaerob-wachsender, Sporen-bildender, grampositiver Keim, der Ende der 70er Jahre als ätiologisches Agenz der Antibiotika-assoziierten Diarrhoe und der Pseudomembranösen Kolitis identifiziert wurde. Seit den 90er Jahren wird C. difficile weltweit als der bedeutendste Krankenhauskeim der entwickelten Länder angesehen. C. difficile ist ursächlich für ca. 20% aller Antibiotika-assoziierter Durchfälle, 75% aller Antibiotika-assoziierter Colitis- und 100% aller PMC-Fälle. Für diese C. difficile-assozierten Erkrankungen (CDAD) können die von C. difficile produzierten Exotoxine, Toxin A (TcdA) und B (TcdB) verantwortlich gemacht werden. Die Toxine besitzen eine funktionale Organisation, die sie in eine A- und B-Domäne untereilt. Die A-Untereinheit ist die toxische Domäne des Toxins, die kleine GTPasen im Zytosol der Wirtszelle glykosyliert. Die B-Domäne ist verantwortlich für den Transport der A-Domäne ins Zytosol. Während der Aufnahme in die Zelle erfahren die Toxine eine Prozessierung, bei welcher es zur Abspaltung der A- von der B-Domäne kommt. Durch diese Spaltung wird die A-Untereinheit ins Zytosol freigesetzt. Untersuchungen an Toxin B haben gezeigt, das ein zytosolischer Wirtsfaktor für die Spaltung des Toxins verantwortlich ist. Vermutet wurde, dass es sich dabei um eine Protease handelt. Schwerpunkte der Forschung des Labors ist die Erforschung der Toxinprozessierung und der daran beteiligten Wirtsfaktoren.
Mit Hilfe der HPLC-Technik wurden Zellextrakte aufgereinigt und die in der Spaltung auf Toxin B aktive Substanz isoliert. Diese hoch aufgereinigten Fraktionen zeigten allerdings keine proteinchemischen Eigenschaften. Durch eine Reihe von physikochemischen Untersuchungen, konnte bewiesen werden, dass es sich nicht um ein Protein handelt. Massenspektrometrische Analysen von aufgereinigten Fraktionen haben schließlich gezeigt, das die Substanz Phosphat- als auch Hydroxylgruppen besitzt, und das es sich um eine ganze Substanzfamilie handeln kann, deren Mitglieder sich in der Anzahl von Phosphatgruppen unterscheiden. Diese Ergebnisse führten schließlich zu der Familie der Inositolphosphate. Inositolphosphate konnten tatsächlich die Spaltung von Toxin B in vitro induzieren und Inositolhexaphosphat erwies sich dabei als das Inositolphosphat mit der höchsten Aktivität. Zunächst wurde die Anwesenheit einer kontaminanten Protease in der Toxin B-Präparation ausgeschlossen und die Hypothese aufgestellt, das Toxin B sich autokatalytisch spaltet. Diese Hypothese wurde u.a. durch die Beobachtung bestätigt, dass die Spaltung wesentlich effizienter war, wenn Toxin in hoher Verdünnung eingesetzt wurde. Ein deutlicher Hinweis für eine intramolekulare Reaktion. Da die Spaltung durch Pepstatin A inhibiert werden konnte, wie dies bereits in einer Veröffentlichung berichtet wurde, musste eine Aspartat-Protease an der Spaltung beteiligt sein. EPNP, ein Aspartat-Proteasen Inhibitor, der kovalent an das Aspartat im Motiv D(S/T)G des aktiven Zentrums der Protease bindet, inhibierte die Spaltung des Toxins. Massenspektrometrische Analysen nach tryptischen Verdau von EPNP modifiziertem Toxin B, konnten ein Fragment identifizieren, das die kovalente Modifikation mit EPNP trug. Es handelte sich um das Fragment mit dem DSG-Motiv an der Position 1665. Damit konnte bewiesen werden, das Toxin B eine intrinsische Protease trägt, mit dem aktiven Zentrum an Position 1665, und sich in einem autokalaytischen Mechanismus spaltet. Inositolphosphate sind hierbei als essentieller Kofaktor beteiligt. Da Toxin B zu der Familie der großen clostridialen Toxine gehört, lag nahe, dass auch diese Toxine in einer Inositolphosphat induzierten Autoproteolyse prozessiert werden. Dies konnte bestätigt werden. Mikroinjektionsversuche haben außerdem die wichtige biologische Relevanz der Spaltung von Toxin B aufweisen können. Denn ist das Toxin in seiner Spaltung durch EPNP inhibiert, so erreicht die katalytische A-Domäne nicht das Zytosol, die Zelle ist geschützt. Das Toxin ist jedoch weiterhin toxisch falls es direkt ins Zytosol injiziert wird.

Dies ist der erste Bericht eines bakteriellen Toxins, das eukaryotische Signale für eine Inositolphosphat induzierte autokatalytische Proteolyse benutzt, mittels welcher es gezielt seine toxische Untereinheit an dem Ort der Wirkung freisetzt.
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