Inhaltszusammenfassung

Der proteolytische Verdau von Proteinen in Peptide ist ein wichtiger Schritt in der Tandem-Massenspektrometrie. Dabei werden Peptide fragmentiert und die sich ergebenden Fragmentionen geben Aufschluss über die Aminosäuresequenz des zu untersuchenden Proteins. Dabei sind für die Fragmentierung sowohl Länge und Sequenz, als auch der Ladungszustand des Peptids ungemein wichtig. Diese Parameter bedingen sich durch Endoproteasen, die für den proteolytischen Verdau eingesetzt werden. Eine Vorausset...Der proteolytische Verdau von Proteinen in Peptide ist ein wichtiger Schritt in der Tandem-Massenspektrometrie. Dabei werden Peptide fragmentiert und die sich ergebenden Fragmentionen geben Aufschluss über die Aminosäuresequenz des zu untersuchenden Proteins. Dabei sind für die Fragmentierung sowohl Länge und Sequenz, als auch der Ladungszustand des Peptids ungemein wichtig. Diese Parameter bedingen sich durch Endoproteasen, die für den proteolytischen Verdau eingesetzt werden. Eine Voraussetzung hierfür ist die Spezifität der Protease. Trypsin ist bei weitem die gebräuchlichste Protease zur massenspektrometrischen Probenvorbereitung. Allerdings bietet Trypsin keine Komplettlösung. Je nach Fragestellung und Applikation müssen weitere Proteasen eingesetzt werden, um eine komplette Sequenzabdeckung zu gewährleisten und möglichst alle posttranslationalen Modifikationen nachzuweisen, oder bestimmte Proteomklassen (z.B Phosphoproteom , Transmembranproteom) zu charakterisieren. In den letzten Jahren wird vermehrt die Metalloendopeptidase LysN eingesezt, die Peptide N-terminal von Lysin hydrolysiert. Eine rekombinante Gewinnung der Protease gestaltet sich noch immer als äußerst schwierig, weshalb in dieser Arbeit ein Protokoll hierzu etabliert werden sollte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das thermostabile Enzym über eine bemerkenswerte Stabilität gegenüber Harnstoff (bis 5 M) verfügt und unverminderte Aktivität in einem pH-Wertbereich von 5-10 aufweist. Die generierten Peptide eigneten sich optimal für Tandem-MS, zudem konnte anhand eines BSA-Verdaus eine Sequenzabdeckung von nahezu 90 % gezeigt werden. Zusätzlich wurde eine Mutation in das Enzym eingefügt, so dass sich die Spezifität der Protease dahingehend änderte, dass neben Lysin auch Arginin N-terminal geschnitten wurde. Dadurch wurde eine Protease generiert die über die gleiche Erkennungssequenz verfügt wie Trypsin, allerdings „reverse“ Peptide generiert, da N-terminal, und nicht C-terminal von der Erkennungssequenz hydrolysiert wird. Somit konnte eine spezifische Endopeptidase generiert werden, die durch ihre Eigenschaften und ihre Erkennungssequenz den Pool der zur Verfügung stehenden Endoproteasen ergänzt und somit Einzug in die Massenspektrometrie-basierte Proteomik finden kann. rnDes Weiteren wurden in dieser Arbeit die Mechanismen untersucht, die zur Bildung des „dendritic cell aggresome-like induced structures“ (DALIS) führen. Hierbei handelt es sich um eine Art Antigenpool der aus defekten ribosomalen Produkten besteht. Hierdurch wird es der dendritischen Zelle in einem verlängerten Zeitraum ermöglicht Antigene zu prozessieren, welche in der Regel schnell degradiert werden. Die DALIS-Bildung geht mit dem Aktivierungszustand der Zelle einher, weshalb der Fokus in dieser Arbeit auf Signaltransduktionswege gelegt wurde, die zur Aktivierung der DC beitragen. Einzelne Komponenten wurden gezielt inhibiert und die Auswirkung auf die Bildung von DALIS untersucht. Des Weiteren wurde die Rolle der Caspasen bei der DALIS-Bildung evaluiert. rn» weiterlesen» einklappen

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Klassifikation

DDC Sachgruppe:
Biowissenschaften, Biologie