Kurzfassung

Im Rahmen von Assoziationsstudien ist die schnelle und zuverlässige Untersuchung der Allelfrequenz von SNPs von grosser Bedeutung. Allelfrequenzen können, um den Arbeitaufwand zu reduzieren, mit Hilfe von DNA-Pooling Strategien quantifiziert werden. Die Genotypisierung erfolgt anschliessend mit quantitativen Genotypisierungsverfahren, wie zum Beispiel dem uns zur Verfügung stehenden Pyrosequencing. Die konventionelle Herstellung von DNA Pools hat zum einen die DNA-Isolierung aus jeder...Im Rahmen von Assoziationsstudien ist die schnelle und zuverlässige Untersuchung der Allelfrequenz von SNPs von grosser Bedeutung. Allelfrequenzen können, um den Arbeitaufwand zu reduzieren, mit Hilfe von DNA-Pooling Strategien quantifiziert werden. Die Genotypisierung erfolgt anschliessend mit quantitativen Genotypisierungsverfahren, wie zum Beispiel dem uns zur Verfügung stehenden Pyrosequencing. Die konventionelle Herstellung von DNA Pools hat zum einen die DNA-Isolierung aus jeder einzelnen Probe, zum anderen eine exakte quantitative DNA Messung in jeder Probe zur Voraussetzung. Im Rahmen dieses Projekts haben wir eine alternative Pooling-Strategie, die diese Voraussetzungen umgeht, auf Praktikabilität überprüft.
100 Vollblutproben wurden gesammelt und die Leukozytnzahl in den Proben bestimmt. Bis zum weiteren Gebrauch wurden die Proben eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die Blutproben entsprechend ihrer Leukozytenzahl zusammenpipettiert, sodass von jedem Probanden die gleiche Anzahl Leukozyten in den Poll gelangt. Aus dem entstandenen Gemisch wurde DNA isoliert. Parallel dazu wurde aus jeder einzelnen Probe DNA isoliert und die DNA Konzentration ermittelt. Entsprechend der DNA-Konzentration wurden anschliessend Pools erstellt.
Die DNA-Proben der einzelnen Probanden wurden alle gesondert auf 4 häufige Polymorphismen hin untersucht und schliesslich die Allelfrequenz der Polymorphismen im Kollektiv errechnet (Goldstandard).
Die erstellten DNA- und Leukozyten-Pools wurden ebenfalls genotypisiert. Mit Hilfe der Genotypisierung von Proben mit bekanntem Genotyp, bzw. mit gezielten Mischungen dieser Proben konnten Kalibratoren für die Allelquantifizierung gewonnen werden. Die Allelqunatifizierung in Pools und Kalibrationsproben wurde jeweils 3-fach durchgeführt. Mit Hilfe der Kalibrationskurven konnte schliesslich die tatsächliche Allelfrequenz in den gepoolten Proben ermittelt werden. Die Abschätzung der SNP-Frequenz gelang mit Hilfe von Leukozyten- und DNA-Pools in gleicher Qualität.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Leukozyten- und DNA-Pooling Strategien gleichermassen geeignete Methoden sind, um Allelfrequenzen in Kollektiven zu bestimmen. Der Leukozyten-Pooling Ansatz ist allerdings deutlich schneller, weniger arbeitsaufwändig und billiger.
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