Kurzfassung

Um die phänotypische Charakterisierung von Immunzellen vorzunehmen, die den Ösophagus bei Patienten mit Achalasie infiltrieren, wird die FACS-Analyse angewandt. Diese Methode ist hoch sensitiv und erbringt quantitative Resultate. Mononukleäre Zellen die vom ösophagealen Muskel extrahiert werden während einer extramukösen Kardiomyotomie, werden mit monoklonalen Antikörpern inkubiert: Anti-CD3 (T-Lymphozyten), Anti-CD19 (B-Lymphozyten), Anti-CD4 (T-Helferzellen), Anti-CD8 (T-Suppressor/...Um die phänotypische Charakterisierung von Immunzellen vorzunehmen, die den Ösophagus bei Patienten mit Achalasie infiltrieren, wird die FACS-Analyse angewandt. Diese Methode ist hoch sensitiv und erbringt quantitative Resultate. Mononukleäre Zellen die vom ösophagealen Muskel extrahiert werden während einer extramukösen Kardiomyotomie, werden mit monoklonalen Antikörpern inkubiert: Anti-CD3 (T-Lymphozyten), Anti-CD19 (B-Lymphozyten), Anti-CD4 (T-Helferzellen), Anti-CD8 (T-Suppressor/ cytotoxische Zellen) und Anti-CD25 (T-reg). Der funktionelle Status dieser Zellen, die die ösophageale Muskulatur infiltrieren, wird durch Untersuchung von spezifischen Aktivationsmarkern (HLA-DR, CD80, CD70, CD71) und der Expression von Integrinrezeptoren (CD29, CD38, CD49a) analysiert. Um systemische Abnormalitäten auszuschließen, werden mononukleäre Zellen (PBMC) aus Blutproben, die vom gleichen Patienten zum Zeitpunkt der Operation isoliert werden, untersucht. Als Kontrollen dienen mononukleäre Zellen des Ösophagus, die im Rahmen von Autopsien entnommen werden.
In einem weiteren Schritt werden Charakteristika des alpha/beta T-Zell Rezeptor- (TCR)-Repertoires innerhalb der Lymphozytenpopulation des Plexus myentericus untersucht. Mononukleäre Zellen, die die ösophageale Muskulatur bei Patienten mit Achalasie, nicht aber bei Kontrollen infiltrieren, proliferieren und schütten inflammatorische Zytokine nach der Exposition mit dem HSV-1-Antigens, was nahe legt, dass diese Zellen Gedächtnis-T-Lymphozyten sind. Der Großteil der T-Lymphozyten benutzt den alpa/beta T-Zell Rezeptor (TCR), um speziell Antigene zusammen mit dem Klasse I und II Histokompatibilitäts-Komplex zu erkennen. Jedoch wurde bei verschiedenen Erkrankungen eine Bias der Expression einiger T-Zell Rezeptor beta-variablen (TCRBV) Regionen in Geweben, die bei immunmediierten inflammatorischen Reaktionen, die der Exposition mit dem relevanten Antigen folgen, involviert sind, demonstriert, im Gegensatz zu dem peripheren Blut-TCRBV-Repertoire. Somit bleibt es zu bestimmen, ob es sich um eine oligo- oder polyklonale T-Zellpopulation handelt mittels Evaluation des TCRBV-Repertoires in den Lymphozyten, die den unteren Ösophagussphinkter infiltrieren.
Hierzu untersuchen wir die TCRBV-Gene durch Sequenzanalysen von CD8+ T-Zellpopulationen sowohl im unteren Ösophagussphinkter als auch im peripheren Blut bei Patienten mit Achalasie. Um den präferentiellen Gebrauch variabler Regionen zu analysieren, wird jede TCRBV-Region mit Hilfe eines 26 VB-Primers, der spezifisch für 24 TCRBV-Familien ist, und einen TCRBC-Primer amplifiziert. Um die Differenzen der TCRBV Gen-Klonalität zu evaluieren wird die CDR3-Länge durch Gen-Scan-Analyse angewandt. Wir expandieren die mononukleären Zellen durch Kultur in Anwesenheit von Interleukin (IL)-2 für 72-96 Stunden.
Desweiteren erfolgt die Identifikation der Epitope, die von den Lymphozyten erkannt werden, die bei Patienten mit Achalasie den unteren Ösophagussphinkter infiltrieren. Obwohl die mononukleären Zellen des Plexus myentericus bei Patienten mit Achalasie nach der Exposition von UV-inaktivierten HSV-1-Partikeln proliferieren können, konnten weder spezifischen viralen Antigene, die die Immunzellen aktivieren können, identifiziert werden noch das Zytokin-Profil nach der viralen Alteration untersucht werden. Um einen Antigen-spezifischen Trigger zu identifizieren, werden entweder rekombinante Virusproteine, die sich auf der Oberfläche und im Kern der Virione befinden (z.B. exprimiert HSV-1 gD, gE, gC und VP5, VP23) als auch synthetische Peptide, die immundominante Sequenzen kodieren, gebraucht, um mononukleäre Zellen zu stimulieren, die aus dem Ösophagus von Achalasie-Patienten und Kontrollen isoliert werden. Die monomukleären Zellen werden für 5-7 Tage mit dem spezifischen Stimulus inkubiert und die Antigen-spezifische Antwort wird durch die Bestimmung der T-Zell-Proliferation unter 3H-Thymidin-Inkorporation und Antigen-spezifischem Zytokin-Syntheseprofil mittels FACS-Analyse. Hierbei werden IFN-gamma, IL-2, Il-4, IL-6 und IL-10 bestimmt und ebenfalls mit der FACS-Analyse die Expression der T-Zellaktivierungsmarker (CD80, CD71, CD71) quantifiziert. Abschließend werden die Resultate der aus dem Ösophagus isolierten mononukleären Zellen mit PBMC verglichen, um das Vorhandensein von systemischen Abweichungen auszuschließen.
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