Kurzfassung

Amplifikation interessierender Sequenzen mit Hilfe der PCR wird allgemein als der Goldstandard betrachtet, um Mutationen in Krankheit-verursachenden Genen zu detektieren. Ausgangspunkt des Projekts war ein Fall von vollständigem „Allele Dropout“ (ADO) im Rahmen der molekulargenetischen Analyse des MEN1 (multiple endokrine Neoplasie Typ 1) Gens. Wir beobachteten die eindeutige und reproduzierbare Homozygotie einer homozygot als letal zu bewertenden Deletion in Exons 2 in der genomischen DNA...Amplifikation interessierender Sequenzen mit Hilfe der PCR wird allgemein als der Goldstandard betrachtet, um Mutationen in Krankheit-verursachenden Genen zu detektieren. Ausgangspunkt des Projekts war ein Fall von vollständigem „Allele Dropout“ (ADO) im Rahmen der molekulargenetischen Analyse des MEN1 (multiple endokrine Neoplasie Typ 1) Gens. Wir beobachteten die eindeutige und reproduzierbare Homozygotie einer homozygot als letal zu bewertenden Deletion in Exons 2 in der genomischen DNA Probe einer jungen Erwachsenen mit multiplen Insulinomen. Zudem fiel ein eigentlich harmloser Polymorphismus in der Nähe der Splice Acceptor Site des Intron 1 auf.
Um der Ursache dieses Phänomens zu untersuchen, wurde ein sog. „Sampling Error“ durch Isolation von DNA aus einem zweiten Aliquot Blut ausgeschlossen. Ebenfalls ausgeschlossen wurden als ADO-Ursachen genetische Veränderungen im Bereich der Primer-Bindungsstellen (durch die Wahl einer Reihe anderer Primer Sets) und das Cycle Sequencing Verfahren (durch Ersatz des Beckman Verfahrens durch das ABI Verfahren, sowie das Pyrosequencing Verfahren). Den tatsächlichen, nämlich heterozygoten Status der Deletion in Exon 2 zeigte erst die Sequenzierung der MEN1 cDNA der Patientin. Nach Ersatz der zunächst verwendeten Taq Polymerase durch Pfu konnten wir schliesslich auch bei Amplifikation genomischer DNA die Heterozygotie der Deletion in Exon 2 und die Heterozygotie des genannten Polymorphismus detektieren. Für diesen Effekt ist allerdings nicht die „Proofreading“ Funktion der Pfu verantwortlich, sondern das jeweilige Puffersystem, denn der Austausch der jeweils mitgelieferten Puffer führte dazu, dass die Taq-Polymerase das richtige und die Pfu das falsche Ergebnis lieferte. Die Amplifikation von PCR-Produkten, die nur die Deletion, nicht aber den Polymorphismus enthalten, führt nicht zum ADO-Phaenomen. Diese Beobachtungen leiteten uns zu der Annahme, das die sehr C-reiche, charakteristische Sequenz (>50%) um den Polymorphismus herum zu einer DNA-Sekundärstruktur führt, die für Polymerasen ein schwieriges Template darstellt. Unter bestimmten Salzbedingungen wird diese Sekundärstruktur so ungünstig, dass eine asymmetrische PCR ein bestimmtes Allel bevorzugt. Um die Theorie der „charakteristischen Sequenz“ zu prüfen, durchsuchten wir die in der dbSNP vorgehaltenen Daten und die Literatur auf SNPs mit ähnlicher Sequenzumgebung. Zwei der so ausgewählten Sequenzen zeigten ADO; einer davon in einem noch deutlicheren Ausmass als der ursprüngliche SNP. Mit Hilfe unterschiedlicher MgCl2-Konzentrationen konnten alle denkbaren Genotypen und deren fliessende Übergänge (Quantifizierung mittels Pyrosequencing) künstlich erzeugt werden. Erstaunlich war dabei vor allem, dass gerade die typischerweise für die PCR verwendeten MgCl2-Konzentrationen zu falschen Ergebnissen führten und nur extreme Salzbedingungen den wahren Genotypen zeigten.
Die von uns für das ADO-Phänomen als ursächlich betrachteten Sequenzen kommen im Genom nicht selten vor. Sie stellen ein ernstes analytisches Problem für alle PCR-basierten Methoden dar, das zu falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen in der genetischen Diagnostik (auch der Pränataldiagnostik) führen kann, ganz zu schweigen von fehlerhaften Genotypisierungsergebnissen im Rahmen von wissenschaftlichen Untersuchungen. Mit Hilfe folgender Massnahmen kann man das Phaenomen erkennen und ihm entgegen wirken:
(1) durch das Überprüfen der Sequenz auf eine mögliche Neigung zu ADO mit Hilfe des von uns entworfenen Algorithmes,
(2) durch die Untersuchung verdächtiger PCR-Methoden mit Hilfe des von uns vorgeschlagenen PCR-Puffersystems und
(3) durch das regelmässige Prüfen der SNPs innerhalb der routinemässig untersuchten Region auf ein eventuelles Heterozygotendefizit (Berechnung des Hardy-Weinberg-Äquilibriums).
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