Kurzfassung

Pyrosequencing ist ein neuartiges Sequenzierverfahren (verfügbar seit 1998), das auf dem „Real Time Monitoring“ des Nukleotid-Eibaus in einen entstehenden DNA-Strang beruht. Es unterscheidet sich von den herkömmlichen Sequenzieren nach Sanger bzw. dem „Cycle Sequencing“ jedoch nicht nur methodisch grundsätzlich, sondern auch was seine Einsatzgebiete betrifft. Die Methoden sind also nicht in der Lage, sich gegenseitig zu ersetzen, sondern können als weitgehend komplementär betrachtet werden....Pyrosequencing ist ein neuartiges Sequenzierverfahren (verfügbar seit 1998), das auf dem „Real Time Monitoring“ des Nukleotid-Eibaus in einen entstehenden DNA-Strang beruht. Es unterscheidet sich von den herkömmlichen Sequenzieren nach Sanger bzw. dem „Cycle Sequencing“ jedoch nicht nur methodisch grundsätzlich, sondern auch was seine Einsatzgebiete betrifft. Die Methoden sind also nicht in der Lage, sich gegenseitig zu ersetzen, sondern können als weitgehend komplementär betrachtet werden. Das herkömmliche Sequenzieren findet sein Haupteinsatzgebiet, auch in unserem Labor, in der de novo Sequenzierung relativ langer DNA-Fragmente; die Leseweite des Pyrosequencing ist hingegen auf 150 b beschränkt. Für eine Reihe von Routine- und High Throughput-Genotypisierungsanwendungen wird jedoch nur eine Kurzstreckensequenzierung benötigt, für die aber folgende Eigenschaften wünschenswert sind und durch das Pyrosequencing weit besser erfüllt werden als durch herkömmliche Sequenzierung: Die Methode muss gut automatisierbar sein, 96 Proben sollen parallel abgearbeitet werden, eine 96-Well Platte sollte das eingesetzte Gerät möglichst kurz belegen und die verbrauchten Reagenzien sollten möglichst günstig sein. Das von uns eingesetzte Gerät Biotage PSQ arbeitet beispielsweise 96 Proben parallel ab, benötigt für eine Platte 10 bis 15 Minuten und verbraucht für eine Sequenzierreatktion Reagenzien im Wert von 50 bis 90 Cent. Da das Verfahren so günstig und schnell ist und auf einer Platte beliebig viele verschiedene Tests auf einmal abgearbeitet werden können, lohnt es sich unter bestimmten Bedingungen auch indirekte Verfahren der SNP-Analyse (z.B. LightCycler oder TaqMan Verfahren, die auf den Einsatz teurer fluoreszenter Sonden und spezieller PCR-Mixe angewiesen sind) durch die Analyse mit Hilfe des Pyrosequencing-Systems zu ersetzen.
Das Pyrosequencing ermöglichte es uns zum einen, einige neue Routine-Anwendungen schnell zu etablieren: 13 im deutschen Kollektiv häufige CF-Mutationen (Diagnostik der Mukoviszidose), der UGT1A1 Promotor-Polymorphismus (Diagnostik des Gilbert-Syndrom und der Irinotekan-Unverträglichkeit) und die Exon 14 Skipping-Mutante der DPD (Diagnostik der 5-FU Unverträglichkeit) konnten in unser Genotpisierungsangebot aufgenommen werden. Zudem konnte das Verfahren zur Analyse das Laktase Polymorphismus (Diagnostik der Laktose Intoleranz) von einem kommerziellen LightCycler Verfahren auf einen um ein Vielfaches billigeren In House Test umgestellt werden. Methoden für folgende weitere Analytik wurden etabliert und validiert: Fatktor V Leiden und Prothrombin-Genmutation (Diagnostik der Thrombophilie), Thiopurin-S-Methyltransferase (Diagnostik der Thioguanin-Unverträglichkeit), ApoE und ApoB-100 (Diagnostik der familiären Hypercholesterinämie), α-1-Protease Inhibitor Polymorphismus (Diagnostik des α-1-Antitrypsin-Mangels). Im Rahmen der Konsolidierung und Rationalisierung der Laborabläufe im Neubau soll das Pyrosequencing die bislang durchgeführten Verfahren ablösen. Nicht zuletzt sind wir in der Lage im Rahmen von Kooperation die Genotypisierung von beliebigen SNPs inklusive Assay Design in grösserem Umfang anzubieten. Sowohl Einzeltypisierungen, wie auch Pooling-Ansätze mit Allelquantifizierung sind möglich.
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