Kurzfassung

Die Arbeitsgruppe Massenspektrometrie bietet die Möglichkeit, Proteine durch Analyse der durch tryptischen Verdau generierten Fragmente zu identifizieren. Die hierzu notwendigen Methoden der Probenvorbereitung (Elution der Proteine aus SDS-PAGE Gelen, tryptischer Verdau und Clean-Up der Fragmente) werden momentan in der Abteilung etabliert und sollen im Rahmen dieses SFB Projektes weiterhin optimiert werden, beispielsweise durch Einsatz von Detergentien, die ein höhere Effizienz des...Die Arbeitsgruppe Massenspektrometrie bietet die Möglichkeit, Proteine durch Analyse der durch tryptischen Verdau generierten Fragmente zu identifizieren. Die hierzu notwendigen Methoden der Probenvorbereitung (Elution der Proteine aus SDS-PAGE Gelen, tryptischer Verdau und Clean-Up der Fragmente) werden momentan in der Abteilung etabliert und sollen im Rahmen dieses SFB Projektes weiterhin optimiert werden, beispielsweise durch Einsatz von Detergentien, die ein höhere Effizienz des tryptischen Verdaus bedingen (RAPIGEST SF), durch Testen unterschiedlicher Methoden zum Clean-Up der Peptidfragmente sowie verbessertes Probenhandling.
Die Empfindlichkeit des Systems soll weiter verbessert werden und die Nachweisgrenze für Peptide unter die derzeitige Schwelle von 1 fmol gesenkt werden. Hierzu soll das analytische System, bestehend aus einer Mikrokapillar-UPLC (Ultra Pressure Liquid Chromatography, für Drücke bis zu 5000 psi, ausgelegt für Kapillarsäulen mit 75 – 100 µm I.D., bei ohne Flow-Split erzeugten Flußraten von 200-400 nl/min, das an ein ESI-Q-TOF Massenspektrometer ( Q-TOF Premier, Waters) gekoppelt ist, mittels synthetischer Peptide geeicht werden. Hierdurch erhält man neben der Information über die Masse für ein bestimmtes Peptid auch die spezifische Retentionszeit. Durch Kombination dieser beiden Informationen lassen sich bei der Auswertung der Massenchromatogramme in Verbindung mit der Aufkonzentrierung und Auftrennung durch die UPLC Peptide im Bereich von wenigen fmol zuverlässig detektieren. Diese Nachweisgrenze soll durch Einsatz optimierter Trennsäulen (1.7 µm Säulenmaterialien oder monolithische Säulen) sowie Optimierung der Trennbedingungen, durch direkte Koppelung der Mikrokapillarsäulen an die NanoSpray-Quelle des Massenspektrometers und den Einsatz optimierter NanoSpray-Nadeln (PicoTips, New Objective) in den Subfemtomol-Bereich verschoben werden. Außerdem sollen durch Analyse des Fragmentierungsverhaltens der eingesetzten synthetischer Peptide im MS/MS-Modus Erkenntnisse für die Interpretation von Fragmentspektren in der Nähe der Nachweisgrenze gewonnen werden, die später für die zuverlässigere Interpretation von nicht eindeutigen Fragmentspektren herangezogen werden können.
Weiterhin werden Methoden zur Quantifizierung von Peptiden etabliert und neu entwickelt. Geplant sind einerseits die relative Quantifizierung von Peptiden aus unterschiedlichen Quellen (beispielswiese aus infiziertem und nichtinfiziertem Gewebe) mittels ICAT-Technologie oder Nicotinylierung mit isotopenmarkierter Nicotinsäure und anschließender relativer Quantifizierung der unterschiedlichen Proben über die gemessenenen Ionenströme. Anderseits sollen verschiedene Methoden zur absoluten Quantifizierung von Peptiden neu entwickelt werden, die auf einer Derivatisierung mittels Fluoreszenzfarbstoffen und anschließender Detektion der Peptide über UV- oder Fluoreszenz mittels einer Kapillarflußzelle zwischen Kapillarsäule und NanoSpray-ESI-Quelle beruhen. Weiterhin ist die Quantifizierung von Peptiden über die Aufnahme von Eichkurven entsprechender synthetischer Peptide geplant. Die datenbankunterstützte Auswertung der Massenchromatogramme und Fragmentspektren erfolgt über die Software MassLynx 4.0» weiterlesen» einklappen